你是否考虑在神经科学研究中使用光遗传学,但不确定从哪里开始?在这里,我们提供了光遗传学及其在神经科学领域应用的关键工具和技术的概述。
光遗传学是什么?
光遗传学是神经生物学领域一项相对较新的技术,它结合了光(光学)和基因工程的使用来操纵神经活动。它广泛地涉及到用光敏蛋白(视蛋白)转染神经元,视蛋白的类型不同,可以通过可见光脉冲选择性地激活或抑制这些神经元。
光遗传学现在已经在神经科学领域占据了一席之地,并彻底改变了我们研究大脑的方式。在它的应用之前,它是挑战科学家的歧视神经通路:与某些生理反应和行为有关的神经通路替代方法,如药理学或电刺激,缺乏光遗传学工具所能达到的相同的时间和解剖精度。
随着的快速发展相关技术,光遗传学已经打开了治疗应用的大门,如脑深部刺激治疗帕金森病,预防癫痫发作,甚至在心脏肌肉起搏治疗心功能障碍。
光遗传学提供了一种高度定向的方法,从活组织中单个神经元的规模,到自由移动的动物,使它成为任何神经科学研究人员的强大工具。
那么它是如何工作的呢?
虽然现在有很多技术都属于光遗传学的范畴,但通常可以分为两大类;用于在靶组织中表达视蛋白的工具,以及用于刺激(激活/失活细胞)和测量产生的反应的工具。
本视频概述了一些用于视蛋白表达和刺激的工具和技术在活的有机体内动物研究,我们将在下面详细介绍。
视蛋白在靶组织中的表达
因为微生物视蛋白在哺乳动物组织中不会自然表达,所以靶细胞必须经过基因工程才能表达这些蛋白质。
有几种技术可用于将视蛋白引入活细胞,包括DNA转染、电穿孔和转基因表达系统。在大脑中,病毒介导的基因传递已经成为大多数神经科学家的选择方法,因为它能够更精确地针对脑组织的不同区域。
病毒表达系统有三个主要组成部分:
- 视蛋白-光敏蛋白
- 启动子-用于靶向特定的细胞类型
- 报告器-用于检测和量化蛋白质的表达量,如绿色荧光蛋白(GFP)
每一个组成部分都可以根据特定的研究问题进行调整。例如,有数百种不同类型的视蛋白变体,每一种都有自己独特的光谱和动力学特征,可用于针对不同类型的细胞并引发不同的生理反应(图1)。
图1.不同视蛋白变体的例子。暴露在蓝光下,通道视紫红质2 (ChR2)允许阳离子进入细胞引起兴奋反应。相反,暴露在黄光下的嗜盐紫红质(NpHR)会产生抑制反应。
例如,通道视紫蛋白是视蛋白的一种常用的“兴奋性”变体,它能激活细胞对蓝光的反应。而卤视紫质是一种抑制性视蛋白,它对黄光做出反应,允许负离子涌入细胞,抑制神经元活动。
同样,在光遗传学工具包中也有各种病毒表达系统,每一种都设计用于不同的动物模型或促进不同类型的视蛋白表达。
腺相关病毒(AAV)是小动物研究中使用最广泛的病毒载体,因为它感染神经组织的特异性和与其他病毒载体相比相对较低的炎症率。
一旦病毒载体构建和扩增完成,一般使用微注射将病毒输送到大脑的目标区域。然后病毒会感染局部神经元并传递构造。这些神经元中被选中的一个子集将具有激活启动子并在细胞中表达视蛋白的正确细胞机制。
要了解更多关于病毒载体表达系统的详细信息,以及创建和分离用于光遗传学研究的病毒载体的步骤,请查看这个有用的指导.
视蛋白表达细胞的光刺激
光遗传学研究需要考虑的第二个主要因素是刺激视蛋白表达细胞并测量产生的反应所需的工具。大多数光瞄准装置可用在活的有机体内动物研究包括使用一个拴着的或无线头戴系统,外加一个辅助设备来记录生理反应。
虽然自光遗传学最初应用以来,栓系和头戴式系统有了显著的改进,但它们仍然有其局限性,包括:
- 界面部位感染易感性增加
- 对正常生理和行为的影响(由于系绳或笨重的头饰)
- 由于电池寿命限制和/或限制,实验持续时间和协议的限制
- 系绳维护和更换的额外费用
Telemetry-based光刺激
随着光遗传学现在转向治疗性研究应用,需要更适合长期研究的光传输/刺激工具。因此,基于无线遥测技术的系统在活体动物研究中越来越受欢迎,因为它们有助于在动物的家庭环境中进行长期、不受限制的实验。
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请注意,ADInstruments无法支持客户开发视蛋白表达的病毒载体。如果您是光遗传学的新手,我们建议您与在创建病毒载体表达系统所需技术方面有经验的研究人员合作。
有用的资源:
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